VĚDECKÉ INFORMACE O VLASTNOSTECH A FUNKCI TPA – STRUČNÝ PŘEHLED

Thymic Protein A je jednořetězcový glykoprotein, který je v laboratoři izolovaný ze supernatantu tkáňové kultury sekrečních buněk brzlíkového epitelu. Molekulová hmotnost je 50kDa, izoelektrický bod 6.5. Aminokyselinové složení: Asparagine/Aspartate–8.8%; Threonine–3.5%; Serine–14.7%; Glutamine/Glutamate–13.3%; Proline–2.2%; Glycine–25.7%; Alanine–6.1%; Valine–4.3%; Isoleucine–3.4%; Leucine–6.3%; Tyrosine–2.3%; Phenylalanine–2.6%; Histidine –2.2%; Lysine–4.7%. Pro biologickou aktivitu je kritická vysoká  glykosylace a  fosforylace. Strukturálně nikoliv funkčně má nejblíže k inhibitorům serinových proteáz ze superrodiny SERPINŮ. 

Přenesení produkční části brzlíkového epitelu do tkáňové kultury v podobě klonů specifických buněk umožnilo získat kompletní přírodní neporušený protein, který má dramaticky vyšší účinek na imunitní stimulaci, než produkty separované přímo ze zvířecích brzlíků nebo izolované separátně od kompatibilních strukturálních proteinů brzlíkového epitelu, např. thymulin.. Protein je citlivě purifikován a upraven tak, aby byla zachována jeho biologická účinnost. Všechny ostatní proteiny, fragmenty nebo látky jsou během čištění odfiltrovány a zůstane pouze jediný brzlíkový protein A, který je následně lyofilizován a smíchán z důvodu jeho stabilizace a zachování funkčnosti s maltodextrinem. Nejvýznamnější působení TPA v těle je stimulace maturace  naivních CD4+ lymfocytů a diferenciace na Th1, stimulace apoptózy a stimulace hematopézy.

 

 

V následujícím textu vycházíme ze znění patentů https://patents.google.com/patent/US7776818B2/en?oq=us7776818, https://patents.google.com/patent/US20070190025A1/en, https://patents.google.com/patent/US5616554A/en

 

 

ÚLOHA TPA V IMUNITNÍM SYSTÉMU – EXPERIMENTY, KLINICKÉ STUDIE

TPA= Epithyme = TISF = S-CELERGIN

TISF stimuluje nebo reguluje proliferaci a diferenciaci lymfocytů a jiných hematopoetických progenitorů, včetně prekurzorů T buněk. TISF má největší účinek na zvýšení odpovědi zralých T lymfocytů na infekční agens a na maligní buňky.
Primárním kritériem účinnosti TISF je jeho schopnost indukovat imunitní funkci v populaci buněk, které bez této indukce nefungují. Thymocyty se skládají z nezralých buněk, které jsou nefunkční, a zralých T buněk, které mohou být stimulovány, aby fungovaly proti různým činidlům, jako jsou viry a nádory. Původně byla tato nezralá buněčná populace používána k testování faktoru z thymických epiteliálních buněčných kultur. Jak je dokumentováno v Beardsley, et al., PNAS 80: 6005 (1983), myší thymický buněčný faktor může vyvolat velmi podstatnou imunitní odpověď v populaci buněk, které normálně nereagují. Zatímco TISF má mírný, ale rozpoznatelný stimulační účinek na tyto nezralé buňky, jeho primární působení je zaměřeno na zralý T lymfocyt, což má za následek zvýšenou virovou nebo nádorovou imunitu. TISF se liší od IL-2 nebo IL-1, které mohou mít podobné, ale méně dramatické účinky. Hlavní rozdíl je v tom, že thymocyty potřebují pouze pulzovat TISF po dobu 24 hodin, zatímco IL-2 musí být přítomen během 5denní indukční fáze odpovědi. TISF má jako primární cíl svého stimulačního účinku nereagující zralý T lymfocyt.
Bylo prokázáno, že TISF podporuje reakci populace pomocných buněk. OBR. 1B ukazuje, že TISF ovlivňuje LYT-2 negativní populaci. Naopak kultury postrádající L3T4 pozitivní pomocné buňky (obr. 1C) nemají žádnou aktivitu.

TISF může výrazně zvýšit nebo zesílit jak protilátkami zprostředkované, tak zabíječské buněčné reakce proti infekčním agens a/nebo rakovině prostřednictvím svého účinku na buňky produkující IL-2. Ukázalo se, že obrovský účinek TISF je způsoben jeho schopností stimulovat produkci IL-2. To je znázorněno na Obr. 2A blokováním TISF zesílení aktivity cytotoxického zabijáka protilátkou namířenou proti IL-2 receptoru (7D4 nebo 3C7). Irelevantní protilátky nemají žádný blokující účinek (obr. 2B). Z terapeutického hlediska má smysl rekrutovat pomocné buňky, aby vytvořily IL-2 v místě, kde jsou vyžadovány, spíše než injekčně podávat bolus IL-2, který se rychle ředí a degraduje v tělesné tekutině.
Několik společností se pokusilo prokázat účinnost IL-2, jak jako terapeutickou, tak jako adjuvans. Problémy jsou minimálně dvojí. Za prvé, IL-2 je lokální, krátkodobě působící cytokin. K dosažení fyziologických hladin na požadovaném místě, tj. nádorové mase, musí být podávány nepřirozeně velké dávky. Tím se dramaticky zvyšuje pravděpodobnost, že pacient bude trpět vedlejšími účinky. Za druhé, IL-2 musí být přítomen nepřetržitě po dobu alespoň pěti dnů, aby se vyvolala účinná reakce.

Naproti tomu látka, kterou nazýváme TISF, je normálně přítomna v krvi ve fyziologicky měřitelných hladinách, s výjimkou určitých chorobných stavů. Jeho způsob účinku je rozšířen na buňky imunitního systému v celém těle. Vzhledem k tomu, že jde o normální složku v oběhu, lze očekávat jen málo vedlejších účinků, pokud vůbec nějaké. Největší výhodou je však to, že jediná injekce TISF má dlouhodobé účinky a lze ji podávat samostatně podobně jako inzulín, pouze méně často.

Bylo stanoveno, že TISF není žádný z dříve popsaných cytokinů. TISF není IL-1 nebo IL-2. Další testování také ukázalo, že TISF není IL-4. To bylo stanoveno inkubací přirozených zabíječských (NK) buněk buď s IL-4 nebo TISF purifikovaným ze supernatantu kultury a měřením inkorporace [125I]-deoxyuridinu do RNA. Léčba IL-4 vedla k významnému zvýšení inkorporace značky, zatímco léčba TISF neměla žádný účinek.

Kromě toho bylo zjištěno, že TISF neobsahuje žádný IL-5 nebo faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), jak je uvedeno v tabulce 3. Skutečnost, že TISF nemá žádnou přímou stimulační aktivitu pro B buňky, naznačuje, že také není IL-3, IL-6 nebo IL-7. Probíhá další čištění a genetické klonování, aby se konkrétně identifikovaly podrobné molekulární charakteristiky TISF.

Bylo prokázáno, že u psů TPA zesiluje protilátkové reakce na virus vztekliny nejméně pětinásobně. Na grafu č. 3 je znázorněn účinek TPA na titry protilátek proti viru vztekliny u psů očkovaných vakcínou s usmrceným virem vztekliny. V kontrolní skupině, která byla očkována vakcínou usmrceným virem vztekliny potencovanou hliníkem, dosáhly titry protilátek proti viru vztekliny vrcholu během dvou týdnů na úrovni výrazně pod 250. Zvířata v experimentální skupině vykazovala přetrvávající zvýšené titry, které dosáhly vrcholu asi dva týdny po imunizaci, na úrovni přesahující 750.

Ve druhém modelu použitém k testování účinnosti TPA byli psi imunizováni virulentním virem psinky plus adjuvans buď hliník nebo TPA. O virech psinky (Morbillivirus ) je známo, že mají imunosupresivní účinky. Účinnost vakcinace s TPA byla více než dvojnásobná.

U myší je primární ochrana, stejně jako u lidí, zajištěna zvýšenými titry protilátek proti hemaglutininovému antigenu (HA). V primární reakci na infekci chřipkou byly titry HA u myší zvýšeny 8krát. Titry byly 1:20 u mladých myší inokulovaných samotným virem a 1:160 u myší dostávajících virové inokulace plus TPA. Buňkou zprostředkovaná odpověď na chřipkový virus je rozhodující pro zotavení z infekce. To je důležité, protože „buněčná imunitní odpověď – cell-mediated immune (CMI) response“ je zaměřena na vysoce konzervativní, nestrukturální genový produkt exprimovaný na infikovaných buňkách, který je společný všem známým kmenům chřipky A. Pokud se tedy člověk nakazí chřipkou kvůli genetické variabilitě molekuly HA, ráznější reakce CMI by mohla velmi dobře zkrátit dobu trvání nemoci, protože „paměťová“ CMI by byla zkříženě reaktivní se všemi chřipkovými kmeny.

Za účelem testování této možnosti byly myši, které byly infikovány chřipkou s nebo bez TPA , testovány za několik týdnů na jejich sekundární cytotoxickou „killer“ buněčnou odpověď proti cílovým buňkám infikovaným virem chřipky. Aktivita zabíjení měřená lýzou cílových buněk byla zvýšena nejméně 9krát u lymfocytů od příjemců TPA

Bylo prokázáno, že TPA zvyšuje imunitní reaktivitu nebo schopnost reagovat na několik virových onemocnění. Byl proveden experiment, kdy kočkám infikovaným FIV byl podáván jednou nebo dvakrát týdně TPA a sledovalo se zlepšení stavu imunity.
Jedenáct koček ve věku od jednoho do tří let bylo získáno od Dr. Janet Yamamoto z University of California v Davisu. Kočky byly experimentálně infikovány kmenem Petaluma FIV jako kontroly ve studii vakcíny. (Viz Pedersen a kol., Science 235: 790-93 (1987).
Dr. Yamamoto určil všechny kočky jako FIV pozitivní, ale po příjezdu do testovacího zařízení nevykazovaly žádné příznaky onemocnění. Základní testovací protokol je následující:

1. Kočky byly ponechány dva týdny v klidu, aby si mohly odpočinout a aklimatizovaly se.
2. Před zahájením léčby byly odebrány vzorky krve pro stanovení základního počtu lymfocytů resp. poměrů T4/T8.
3. Náhodně byly kočky vybrány do léčebné (6 koček) a kontrolní (5 koček) skupiny.
4. Léčené skupině koček byl subkutánně aplikován 1,0 ml kočičího TPA v purifikované nebo částečně purifikované formě.
5. Vzorky krve byly odebírány každý týden před každou injekcí a byly sledovány klinické příznaky a zaznamenávány nálezy.
6. Byl získán vzorek kostní dřeně a krve pro použití v testu detekce FIV u léčených a kontrolních zvířat.

Šest koček léčených TISF vykázalo statisticky významné zkrácení období lymfopenie, s nímž se setkáváme v časném průběhu onemocnění FIV, ve srovnání s pěti neléčenými kontrolami (obr. 6). Klinicky se experimentálně léčená skupina zotavila mnohem rychleji ze známek virových infekcí horních cest dýchacích, které vykazovalo všech jedenáct zvířat. Konečně vyšetření krve a kostní dřeně zvířat potvrdilo, že skupina experimentálně léčená TISF měla zlepšený virologický stav a celularitu dřeně ve srovnání s kontrolami.

Výsledky léčby symptomatických FIV pozitivních koček na několika soukromých veterinárních klinikách, kterým byl jednou týdně injekčně aplikován TISF jsou následující: Všech osm koček vykazovalo symptomatické zlepšení (výrazné zlepšení gingivitidy, stomatitidy, ústup průjmu, větší chuť k jídlu, zastavený výtok z nosu, zlepšení konjunktivitidy, frkání, hmotnostní přírůstek a také zvýšený počet lymfocytů v periferní krvi po léčbě TISF, např. z 9% na 17%, z 15% na 39%, z 19% na 25%…

TISF produkovaný epiteliálními buňkami thymu skotu byl testován na antivirovou aktivitu proti viru lidské imunodeficience (HIV). Lymfocyty lidské periferní krve použité pro tento in vitro test byly získány od zdravých HIV-negativních dárců a byly purifikovány za použití diskontinuální gradientové centrifugace a média pro separaci lymfocytů (Organon Teknika). Lymfocyty byly nejprve stimulovány fytohemaglutininem (PHA) a poté byly udržovány v médiu RPMI-1640 a DMEM. Buňky z této kultury byly koncentrovány a suspendovány v inokulu známého kmene HIV (H112-2) po dobu dvou hodin. Buňky byly poté promyty, aby se odstranil neabsorbovaný virus, a byly resuspendovány v čerstvém médiu. 2 x 105 buněk bylo rozděleno do jamek 24jamkové destičky. Různé koncentrace bovinního TISF ve dvojnásobných ředěních od 1:5 do 1:160 byly přidány do jamek obsahujících infikované buňky a do kontrolních jamek obsahujících neinfikované buňky.
Interleukin-2 (IL-2) v koncentracích, které se mezi různými destičkami měnily, byl přidán do média, aby se vyhodnotil účinek různých úrovní stimulace lymfocytů. Na každé plotně byly zahrnuty buněčné kontroly (neošetřené, neinfikované) a virové kontroly (neléčené, infikované). Dideoxyinosin (DDI), známé silné anti-HIV činidlo, byl testován jako pozitivní kontrola. Destičky byly kultivovány po dobu 5 dnů při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 % C02. Pátý nebo šestý den po infekci byl odebrán vzorek supernatantového média z každé testovací jamky a testován na koncentraci HIV p24 jádrového antigenu pomocí ELISA (Dupont Company, Boston, MA). Výsledky těchto stanovení znázorněné jako procento snížení koncentrace antigenu p24 ve srovnání s neošetřenými virovými kontrolami jsou uvedeny v tabulce V.

Účinek TISF na buněčný růst byl hodnocen, aby se ověřilo, že virová inhibice, kterou produkoval, nebyla pouze odrazem cytotoxicity proti samotným infikovaným buňkám, spíše než antivirovým účinkem. K identifikaci a kvantifikaci životaschopných buněk z neinfikovaných jamek při každém ředění dávky TISF byl použit test s barvivem MTT-formazan. Tento test se opírá o redukci MTT tetrazoliové soli živými buňkami za vzniku modrého formazanového produktu. Jak je uvedeno v tabulce VI, zatímco určitá cytotoxicita byla pozorována při vysokých dávkách TISF v buňkách pod vysokou stimulací IL-2, při nižších koncentracích a nižších hladinách IL-2, které jsou lépe dosažitelné v terapeutických situacích, byla zaznamenána významná virová inhibice i v přítomnosti zvýšeného růstu buněk

Tato studie prokázala výrazné snížení virové zátěže lidských lymfocytů infikovaných HIV způsobenou TISF, které nebylo způsobeno pouze cytotoxickým účinkem. Zatímco antivirový účinek TISF byl méně silný než účinek DDI, TISF si udržel svou virovou inhibici i za podmínek, kdy také stimuloval zvýšení počtu lymfocytů.

Table V.

                                  TABLE V

ANTIVIRAL ACTIVITY OF TISF IN THE PRESENCE OF IL-2
1.0 u/ml .32 u/ml 0.1 u/ml
Antiviral Antiviral Antiviral
Activity Activity Activity
IL-2 p24 Reduction
p24 Reduction
p24 Reduction
DOSAGE (ng/ml)
(%) (ng/ml)
(%) (ng/ml)
(%)

TISF 1:5 432.9
27.8 247.3
33.6 90.13
46.9
TISF 1:10 517.3
13.7 292.4
21.5 92.93
45.2
TISF 1:20 531.9
11.3 307.2
17.6 98.96
41.7
TISF 1:40 579.3
3.4 313.7
15.8 111.6
34.2
TISF 1:80 571.2
4.7 287.2
22.9 103.7
38.9
TISF 1:160 602.2
-0.4 309.6
16.9 115.5
31.9
VIRAL CONTROL
599.6
-- 372.6
-- 169.6
--
DDI 100 μM
0.312
99.96 ND+
-- ND --
DDI 31.6 μM
4.431
99.4 ND -- ND --
DDI 10 μM
158.8
79.0 ND -- ND --
DDI 3.16 μM
406.4
46.2 ND -- ND --
DDI 1 μM
529.1
30.0 ND -- ND --
DDI .316 μM
551.7
27.0 ND -- ND --
VIRAL CONTROL
755.6
-- ND -- ND --

*HIV p24 core antigen measured by ELISA
+ND = not determined

                                 TABLE VI

EFFECT OF TISF ON CELL GROWTH IN THE PRESENCE OF IL-2
1.0 u/ml .32 u/ml 0.1 u/ml
Cell Cell Cell
Viability
Viability
Viability
IL-2 MTT (%) Cell
MTT (%) Cell
MTT (%) Cell
DOSAGE Abs Growth
Abs Growth
Abs Growth

TISF 1:5 0.994
92.6 0.761
85.1 0.371
81.7
TISF 1:10 1.029
95.8 0.818
91.5 0.433
95.4
TISF 1:20 1.059
98.6 0.828
92.6 0.457
102.9
TISF 1:40 1.085
101.0
0.866
96.9 0.508
111.9
TISF 1:80 1.07
99.6 0.872
97.5 0.541
119.2
TISF 1:160
1.129
105.1
0.889
99.4 0.544
119.8
CELL CONTROL
1.074
100.0
0.894
100.0
0.454
100.0
DDI 100 μM
0.885
74.9 ND+
-- ND --
DDI 31.6 μM
1.096
92.7 ND -- ND --
DDI 10 μM
1.067
90.3 ND -- ND --
DDI 3.16 μM
1.077
91.1 ND -- ND --
DDI 1 μM
1.1 93.3 ND -- ND --
DDI .316 μM
1.169
98.9 ND -- ND --
CELL CONTROL
1.182
100.0
ND -- ND --

*MTT formazan absorption by living cells
+ND = not determined

TPA STIMULACE HEMATOPOÉZY

TPA pozitivně ovlivňuje hematopoézu pravděpodobně mechanismem působení na stimulaci CD4+ lymfocytů. CD4+ lymfocyty regulují produkci všech typů krevních buněk v kostní dřeni, včetně červených krvinek, krevních destiček a granulocytů. Deficit CD-4 lymfocytů by tedy mohl vést k pancytopenii pozorované u subjektů s oslabenou imunitou, včetně pacientů s rakovinou podstupujících chemoterapii nebo u virových nebo jinak chemicky vyvolaných stavů. TISF je nezbytný pro stimulaci zralých T-lymfocytů, což vede ke zvýšené antivirové nebo protinádorové aktivitě. Je popsána jeho účinnost pro léčbu stavů charakterizovaných nedostatkem alespoň jednoho typu krevních buněk vybraných ze skupiny sestávající z červených krvinek, krevních destiček a granulocytů. TISF poskytuje úlevu od těchto stavů tím, že stimuluje tvorbu více krevních buněk typu potřebného ke zmírnění takového nedostatku :

Použitím postupů popsaných v T. R. Ulrich, et al., Blood 86, 971-76 (1995), byly myši léčeny chemoterapeutickým činidlem samotným nebo činidlem plus TISF. Hladiny krevních destiček pak byly stanoveny pro každý subjekt každých několik dní po léčbě. Čtyři dny po léčbě všechna zvířata vykazovala podstatný pokles hladin krevních destiček v průměru na méně než polovinu úrovně před léčbou. Následně subjekty, které nedostaly TISF, vykazovaly malou změnu od 4. do 19. dne. Subjekty léčené TISF vykazovaly statisticky významné zlepšení hladin krevních destiček do 7. dne a do 13. dne se jejich krevní destičky vrátily na úroveň před léčbou.

OBR. 5 je graf poklesu počtu krevních destiček a zotavení u myší, u kterých byl nedostatek krevních destiček indukován chemoterapeutickou léčbou, jak je popsáno v T. R. Ulrich a kol., Blood 86, 971-71 (1995). Ukazuje, že myši, které dostávaly TISF (označovaný jako S-Celergin) spolu s chemoterapií, se zotavily na úroveň počtu krevních destiček před léčbou během přibližně dvou týdnů, zatímco myši, které nedostávaly TISF, vykazovaly po 19 dnech malou obnovu hladin krevních destiček.

Výsledky aplikace TPA kočkám infikovaným FeLV nebo FIV:

OBR. 1 ukazuje zvýšený počet lymfocytů;

OBR. 2 ukazuje zvýšený počet červených krvinek; a

OBR. 3 ukazuje zvýšený počet granulocytů. V každém případě obrázky ukazují, že zvířata se specifickým nedostatkem krevních buněk vykazovala podstatné zlepšení po jedné dávce TISF, přičemž největší nárůst byl pozorován u zvířat se závažnými nedostatky.

OBR. 4 ilustruje zvýšení počtu krevních destiček způsobené podáváním TISF 23 kočkám infikovaným buď FIV nebo FeLV. Ukazuje průměrný nárůst počtu krevních destiček o 200 %.

TPA STIMULUJE BUNĚČNOU APOPTÓZU
Kromě schopnosti stimulovat hematopoézu bylo zjištěno, že TISF je také schopen iniciovat apoptózu v některých buněčných populacích, včetně určitých typů krevních buněk. Zejména bylo zjištěno, že TISF selektivně způsobuje buněčnou smrt nebo zastavení růstu tkáně u aberantních T-buněk, jako jsou lymfomové buňky, lymfocyty, které nesou virus HIV a leukemické buňky. I když se uvádí, že je schopen stimulovat imunitní odpověď, která by teoreticky mohla cílit na maligní buňky bylo zjištěno, že TISF může selektivně způsobit buněčnou smrt v ohrožených T-buňkách v nepřítomnosti jakékoli imunitní reakce, jak bylo prokázáno experimenty in vitro.

TISF je tedy možné použít k léčbě poruch charakterizovaných produkcí, vývojem nebo aktivitou aberantních T-buněk, protože funguje mechanismem nezávislým na stimulaci imunitní odpovědi dříve spojené s TISF. Poskytuje způsoby léčby takových stavů u jedinců s oslabenou imunitou, kde by se neočekávalo, že by léčba spoléhající na stimulaci imunitní odpovědi subjektu dobře fungovala. Například se zvláště dobře hodí k léčbě jedinců s poruchou imunity, jako je HIV, a k léčbě jedinců, kteří současně dostávají imunosupresivní léky. Peptidy TISF jsou tedy užitečné pro léčbu těchto poruch, které zahrnují různé T-buněčné lymfomy, jako je mycosis fungoides, T-buněčné leukémie a některé virové infekce, jako je HIV, které jsou přechovávány T-buňkami.

TISF inhibuje buněčný růst v kultuře lymfomových buněk způsobem závislým na dávce, jak bylo prokázáno experimenty s inkorporací 3H-thymidinu. Bylo také prokázáno, že zvyšuje míru buněčné smrti mezi lymfocyty infikovanými virem HIV. V takových buňkách TISF také zpomalil produkci viru. Kromě toho, když byly buňky lidské myelomonocytární leukemické buněčné linie K562 ošetřeny TISF, úroveň apoptózy v této buněčné kultuře se zvýšila více než dvojnásobně oproti kontrole. Pro srovnání, TISF nevykazoval žádný účinek na rychlost růstu buněk nelymfoidní maligní buněčné linie, což dokazuje, že účinek na lymfomové buňky není obecným cytotoxickým účinkem, ani jej nelze připsat systémové imunitní reakci vyvolané TISF.

TISF Byl také testován na účinek TISF na kožní T-buněčný lymfom (CTCL), za použití myšího xenograftového modelu popsaného T. S. Burgerem a kol., v Experimental Dermatology, sv. 13, 406-12 (2004). Kožní T-buněčné lymfomy (CTCL) jsou skupinou lymfoproliferativních poruch postihujících kůži. Nejběžnější formou je mycosis fungoides (MF), při které dochází k malignímu růstu T-buněk ve formě skvrn a později nádorů na kůži. Id. Burger, et al., popisuje způsob růstu lidských MF nádorů u nahých myší s deficitem imunity a ukazuje, že maligní buňky se šíří do lymfatických uzlin, krevního řečiště a dalších orgánů. Pomocí tohoto modelového systému se nyní ukázalo, že TISF dramaticky zpomaluje růst nádoru CTCL. Účinek se stane zřejmým během dnů po podání dávky TISF a účinek jedné dávky pokračuje po dobu alespoň dvou týdnů během fáze rychlého růstu modelového nádoru, jak je znázorněno na OBR. 1.

Tato data naznačují, že maligní buňky a virem infikované buňky lymfoidního nebo myeloidního původu jsou indukovány TISF k zahájení apoptózy a že tohoto účinku lze dosáhnout in vivo i in vitro. Tato biologická aktivita TISF může být užitečně aplikována na léčbu různých poruch, které jsou charakterizovány aberantními T-buňkami nebo jinými aberantními buňkami hematopoetického původu. Mezi takové poruchy patří různé lymfomy zahrnující T-buňky, včetně T-buněčného lymfomu dospělých, prekurzorového T-buněčného lymfoblastického lymfomu, extranodálního přirozeného zabijáckého T-buněčného lymfomu, enteropatického lymfomu typu T-buněk, hepatosplenického T-buněčného lymfomu, subkutánní panikulitidy jako T-buněk lymfom, mycosis fungoides nebo kožní T-buněčný lymfom (CTCL), Sezaryho syndrom (leukemická fáze CTCL), anaplastický velkobuněčný lymfom, periferní T-buněčný lymfom a angioimunoblastický T-buněčný lymfom. Další poruchy léčitelné způsoby a kompozicemi popsanými v tomto textu zahrnují určité leukémie, jako je dětská leukémie původem z T-buněk, leukémie dospělých T-buněk, lymfocytární leukémie, chronická leukémie T-buněk, myeloidní leukémie a erytroidní leukémie. Tyto poruchy také zahrnují ty virové stavy, kdy jsou infikovány lymfocyty a konkrétně je zahrnuta infekce HIV. TISF může prospívat subjektům majícím HIV také jinými způsoby, kvůli svým imunostimulačním účinkům a podpoře hematopoézy, ale předkládaný vynález poskytuje způsob indukce apoptózy aberantních T-buněk a tím snížení virové zátěže u pacientů s HIV.

Lymfomové buňky byly inkubovány po dobu 48 hodin v přítomnosti TISF v několika různých koncentracích. Buňky byly poté ošetřeny 3H-thymidinem pro měření buněčné proliferace. Při každé koncentraci TISF inhiboval buněčný růst. Jako kontrola pro stanovení, zda účinek byl obecnou cytotoxicitou, byla nelymfoidní maligní buněčná linie také ošetřena TISF a TISF neměl v tomto případě žádný vliv na rychlost růstu.

Lymfocyty infikované virem HIV byly inkubovány s TISF v různých dávkách. Buněčná smrt nastala při každé testované koncentraci a rozsah byl závislý na dávce. Navíc koncentrace TISF korelovala se sníženou produkcí viru.

Lidská myelomonocytární leukemická buněčná linie K562 byla inkubována s TISF. Rychlost apoptózy se zvýšila více než dvojnásobně oproti rychlosti v kontrolní kultuře.

Modelové nádory kožního T-buněčného lymfomu (CTCL) byly založeny u myší metodou popsanou v T. S. Burger, et al., Stanovení myšího xenograftového modelu pro mycosis fungoides, Experimental Dermatology, 13, 406-412 (2004). Přibližně 14 dní po implantaci nádorových buněk byly myši ošetřeny TISF. Objem nádoru v mm3 byl vyhodnocen podle Burgera, et al., jako Velikost = délka x (šířka) 2 x 0,5. Přibližně v době léčby se rychlost růstu nádoru prudce zvýšila u neléčených myší, zatímco jedna dávka TISF významně potlačila rychlost růstu nádoru u léčených zvířat. Výsledky jsou shrnuty na OBR. 1, 4 a 5. Obr. 1 ukazuje, že objem nádoru byl více než dvakrát větší u neléčených myší než u léčených myší tři dny po léčbě. OBR. 4 ukazuje, že silný účinek z jedné dávky je udržován alespoň 19 dní po jediném ošetření a že účinek je mnohem silnější, když se použije purifikovaná kompozice TISF. OBR. 5 ilustruje, že účinek TISF je závislý na dávce.

Šest týdnů staré nahé myši NMRI byly získány od Harlan Winkelmann, Borchen, Německo byly chovány v individuálních ventilovaných klecích, potrava a voda ad libitum. CTCL nádorová tkáň byla implantována v anestezii do boku zvířat 24. listopadu 2004 a velikost nádoru byla monitorována dvakrát týdně za použití metod popsaných v Experimental Dermatology, 13, 406-412 (2004). Skupiny po 10 zvířatech byly použity pro léčebnou skupinu a kontrolní skupinu.

Zvířata v léčebné skupině byla ošetřena 100  μl injekcemi rekonstituovaného roztoku TISF; zvířatům kontrolní skupiny bylo injikováno 100  μl zředěného fyziologického roztoku. Léčba byla podávána denně následovně: 13.-17. prosince 2004; 20.-24. prosince 2004; 27.-31. prosince 2004; a 3.-5. ledna 2005. Zvířata byla utracena 6. ledna 2005.

Když léčba začala, objem nádoru byl přibližně 80 mm3. OBR. 2 ukazuje rychlost růstu nádoru v kontrolní skupině (reprezentované čtvercovými datovými body) a léčené skupině (reprezentované datovými body ve tvaru kosočtverce) a ukazuje, že léčba podstatně zpomalila růst nádoru. Když byla zvířata usmrcena, objem nádoru byl téměř třikrát větší u neléčených (kontrolních) zvířat ve srovnání s léčenými zvířaty. OBR. 3 ukazuje tělesné hmotnosti zvířat a ukazuje, že léčba TISF neměla žádný významný účinek na celkovou rychlost růstu léčených zvířat.

Tkáň z nádorů byla obarvena hematoxylinem a eosinem pro histologické vyšetření. Nádorová tkáň z léčených zvířat vykazovala mírné zvýšení koagulační nekrózy a mírné zvýšení angiogeneze ve srovnání s kontrolami. OBR. 4 ukazuje výsledky histologického vyšetření každého zvířete a Obr. 5 ukazuje reprezentativní snímky nádorové tkáně z léčených a neléčených zvířat.

galery - slider 

zdroj:

informace sdělené Dr. Terry Beardsleyem, Ph.D. 

https://patents.google.com/patent/US7776818B2/en?oq=us7776818

https://patents.google.com/patent/US20070190025A1/en

https://patents.google.com/patent/US5616554A/en