VĚDECKÉ INFORMACE O VLASTNOSTECH A FUNKCI TPA – STRUČNÝ PŘEHLED

Thymic Protein A je jednořetězcový glykoprotein, který je v laboratoři izolovaný ze supernatantu tkáňové kultury sekrečních buněk brzlíkového epitelu. Molekulová hmotnost je 50kDa, izoelektrický bod 6.5. Aminokyselinové složení: Asparagine/Aspartate–8.8%; Threonine–3.5%; Serine–14.7%; Glutamine/Glutamate–13.3%; Proline–2.2%; Glycine–25.7%; Alanine–6.1%; Valine–4.3%; Isoleucine–3.4%; Leucine–6.3%; Tyrosine–2.3%; Phenylalanine–2.6%; Histidine –2.2%; Lysine–4.7%. Pro biologickou aktivitu je kritická vysoká  glykosylace a  fosforylace. Strukturálně nikoliv funkčně má nejblíže k inhibitorům serinových proteáz ze superrodiny SERPINŮ. 

Přenesení produkční části brzlíkového epitelu do tkáňové kultury v podobě klonů specifických buněk umožnilo získat kompletní přírodní neporušený protein, který má dramaticky vyšší účinek na imunitní stimulaci, než produkty separované přímo ze zvířecích brzlíků nebo izolované separátně od kompatibilních strukturálních proteinů brzlíkového epitelu, např. thymulin.. Protein je citlivě purifikován a upraven tak, aby byla zachována jeho biologická účinnost. Všechny ostatní proteiny, fragmenty nebo látky jsou během čištění odfiltrovány a zůstane pouze jediný brzlíkový protein A, který je následně lyofilizován a smíchán z důvodu jeho stabilizace a zachování funkčnosti s maltodextrinem. Nejvýznamnější působení TPA v těle je stimulace maturace  naivních CD4+ lymfocytů a diferenciace na Th1, stimulace apoptózy a stimulace hematopézy.

V následujícím textu vycházíme ze znění patentů https://patents.google.com/patent/US7776818B2/en?oq=us7776818, https://patents.google.com/patent/US20070190025A1/en, https://patents.google.com/patent/US5616554A/en

ÚLOHA TPA V IMUNITNÍM SYSTÉMU – EXPERIMENTY, KLINICKÉ STUDIE

TPA= Epithyme = TISF = S-CELERGIN

TISF stimuluje nebo reguluje proliferaci a diferenciaci lymfocytů a jiných hematopoetických progenitorů, včetně prekurzorů T buněk. TISF má největší účinek na zvýšení odpovědi zralých T lymfocytů na infekční agens a na maligní buňky.
Primárním kritériem účinnosti TISF je jeho schopnost indukovat imunitní funkci v populaci buněk, které bez této indukce nefungují. Thymocyty se skládají z nezralých buněk, které jsou nefunkční, a zralých T buněk, které mohou být stimulovány, aby fungovaly proti různým činidlům, jako jsou viry a nádory. Původně byla tato nezralá buněčná populace používána k testování faktoru z thymických epiteliálních buněčných kultur. Jak je dokumentováno v Beardsley, et al., PNAS 80: 6005 (1983), myší thymický buněčný faktor může vyvolat velmi podstatnou imunitní odpověď v populaci buněk, které normálně nereagují. Zatímco TISF má mírný, ale rozpoznatelný stimulační účinek na tyto nezralé buňky, jeho primární působení je zaměřeno na zralý T lymfocyt, což má za následek zvýšenou virovou nebo nádorovou imunitu. TISF se liší od IL-2 nebo IL-1, které mohou mít podobné, ale méně dramatické účinky. Hlavní rozdíl je v tom, že thymocyty potřebují pouze pulzovat TISF po dobu 24 hodin, zatímco IL-2 musí být přítomen během 5denní indukční fáze odpovědi. TISF má jako primární cíl svého stimulačního účinku nereagující zralý T lymfocyt.
Bylo prokázáno, že TISF podporuje reakci populace pomocných buněk. OBR. 1B ukazuje, že TISF ovlivňuje LYT-2 negativní populaci. Naopak kultury postrádající L3T4 pozitivní pomocné buňky (obr. 1C) nemají žádnou aktivitu.

TISF může výrazně zvýšit nebo zesílit jak protilátkami zprostředkované, tak zabíječské buněčné reakce proti infekčním agens a/nebo rakovině prostřednictvím svého účinku na buňky produkující IL-2. Ukázalo se, že obrovský účinek TISF je způsoben jeho schopností stimulovat produkci IL-2. To je znázorněno na Obr. 2A blokováním TISF zesílení aktivity cytotoxického zabijáka protilátkou namířenou proti IL-2 receptoru (7D4 nebo 3C7). Irelevantní protilátky nemají žádný blokující účinek (obr. 2B). Z terapeutického hlediska má smysl rekrutovat pomocné buňky, aby vytvořily IL-2 v místě, kde jsou vyžadovány, spíše než injekčně podávat bolus IL-2, který se rychle ředí a degraduje v tělesné tekutině.
Několik společností se pokusilo prokázat účinnost IL-2, jak jako terapeutickou, tak jako adjuvans. Problémy jsou minimálně dvojí. Za prvé, IL-2 je lokální, krátkodobě působící cytokin. K dosažení fyziologických hladin na požadovaném místě, tj. nádorové mase, musí být podávány nepřirozeně velké dávky. Tím se dramaticky zvyšuje pravděpodobnost, že pacient bude trpět vedlejšími účinky. Za druhé, IL-2 musí být přítomen nepřetržitě po dobu alespoň pěti dnů, aby se vyvolala účinná reakce.

Naproti tomu látka, kterou nazýváme TISF, je normálně přítomna v krvi ve fyziologicky měřitelných hladinách, s výjimkou určitých chorobných stavů. Jeho způsob účinku je rozšířen na buňky imunitního systému v celém těle. Vzhledem k tomu, že jde o normální složku v oběhu, lze očekávat jen málo vedlejších účinků, pokud vůbec nějaké. Největší výhodou je však to, že jediná injekce TISF má dlouhodobé účinky a lze ji podávat samostatně podobně jako inzulín, pouze méně často.

Bylo stanoveno, že TISF není žádný z dříve popsaných cytokinů. TISF není IL-1 nebo IL-2. Další testování také ukázalo, že TISF není IL-4. To bylo stanoveno inkubací přirozených zabíječských (NK) buněk buď s IL-4 nebo TISF purifikovaným ze supernatantu kultury a měřením inkorporace [125I]-deoxyuridinu do RNA. Léčba IL-4 vedla k významnému zvýšení inkorporace značky, zatímco léčba TISF neměla žádný účinek.

Kromě toho bylo zjištěno, že TISF neobsahuje žádný IL-5 nebo faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), jak je uvedeno v tabulce 3. Skutečnost, že TISF nemá žádnou přímou stimulační aktivitu pro B buňky, naznačuje, že také není IL-3, IL-6 nebo IL-7. Probíhá další čištění a genetické klonování, aby se konkrétně identifikovaly podrobné molekulární charakteristiky TISF.

Bylo prokázáno, že u psů TPA zesiluje protilátkové reakce na virus vztekliny nejméně pětinásobně. Na grafu č. 3 je znázorněn účinek TPA na titry protilátek proti viru vztekliny u psů očkovaných vakcínou s usmrceným virem vztekliny. V kontrolní skupině, která byla očkována vakcínou usmrceným virem vztekliny potencovanou hliníkem, dosáhly titry protilátek proti viru vztekliny vrcholu během dvou týdnů na úrovni výrazně pod 250. Zvířata v experimentální skupině vykazovala přetrvávající zvýšené titry, které dosáhly vrcholu asi dva týdny po imunizaci, na úrovni přesahující 750.

Výsledky léčby symptomatických FIV pozitivních koček na několika soukromých veterinárních klinikách, kterým byl jednou týdně injekčně aplikován TISF jsou následující: Všech osm koček vykazovalo symptomatické zlepšení (výrazné zlepšení gingivitidy, stomatitidy, ústup průjmu, větší chuť k jídlu, zastavený výtok z nosu, zlepšení konjunktivitidy, frkání, hmotnostní přírůstek a také zvýšený počet lymfocytů v periferní krvi po léčbě TISF, např. z 9% na 17%, z 15% na 39%, z 19% na 25%…

TISF produkovaný epiteliálními buňkami thymu skotu byl testován na antivirovou aktivitu proti viru lidské imunodeficience (HIV). Lymfocyty lidské periferní krve použité pro tento in vitro test byly získány od zdravých HIV-negativních dárců a byly purifikovány za použití diskontinuální gradientové centrifugace a média pro separaci lymfocytů (Organon Teknika). Lymfocyty byly nejprve stimulovány fytohemaglutininem (PHA) a poté byly udržovány v médiu RPMI-1640 a DMEM. Buňky z této kultury byly koncentrovány a suspendovány v inokulu známého kmene HIV (H112-2) po dobu dvou hodin. Buňky byly poté promyty, aby se odstranil neabsorbovaný virus, a byly resuspendovány v čerstvém médiu. 2 x 105 buněk bylo rozděleno do jamek 24jamkové destičky. Různé koncentrace bovinního TISF ve dvojnásobných ředěních od 1:5 do 1:160 byly přidány do jamek obsahujících infikované buňky a do kontrolních jamek obsahujících neinfikované buňky.
Interleukin-2 (IL-2) v koncentracích, které se mezi různými destičkami měnily, byl přidán do média, aby se vyhodnotil účinek různých úrovní stimulace lymfocytů. Na každé plotně byly zahrnuty buněčné kontroly (neošetřené, neinfikované) a virové kontroly (neléčené, infikované). Dideoxyinosin (DDI), známé silné anti-HIV činidlo, byl testován jako pozitivní kontrola. Destičky byly kultivovány po dobu 5 dnů při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 % C02. Pátý nebo šestý den po infekci byl odebrán vzorek supernatantového média z každé testovací jamky a testován na koncentraci HIV p24 jádrového antigenu pomocí ELISA (Dupont Company, Boston, MA). Výsledky těchto stanovení znázorněné jako procento snížení koncentrace antigenu p24 ve srovnání s neošetřenými virovými kontrolami jsou uvedeny v tabulce V.

Účinek TISF na buněčný růst byl hodnocen, aby se ověřilo, že virová inhibice, kterou produkoval, nebyla pouze odrazem cytotoxicity proti samotným infikovaným buňkám, spíše než antivirovým účinkem. K identifikaci a kvantifikaci životaschopných buněk z neinfikovaných jamek při každém ředění dávky TISF byl použit test s barvivem MTT-formazan. Tento test se opírá o redukci MTT tetrazoliové soli živými buňkami za vzniku modrého formazanového produktu. Jak je uvedeno v tabulce VI, zatímco určitá cytotoxicita byla pozorována při vysokých dávkách TISF v buňkách pod vysokou stimulací IL-2, při nižších koncentracích a nižších hladinách IL-2, které jsou lépe dosažitelné v terapeutických situacích, byla zaznamenána významná virová inhibice i v přítomnosti zvýšeného růstu buněk

Tato studie prokázala výrazné snížení virové zátěže lidských lymfocytů infikovaných HIV způsobenou TISF, které nebylo způsobeno pouze cytotoxickým účinkem. Zatímco antivirový účinek TISF byl méně silný než účinek DDI, TISF si udržel svou virovou inhibici i za podmínek, kdy také stimuloval zvýšení počtu lymfocytů.

Table V.